Scoperta nel sud della Francia una nuova variante SARS-CoV-2 di probabile origine camerunese che ospita entrambe le sostituzioni N501Y ed E484K nella proteina spike
Philippe Colson , Jérémy Delerce , Emilie Burel , Jordan Dahan , Agnès Jouffret , Florence Fenollar , Nouara Yahi , Jacques Fantini , Bernard La Scola , Didier Raoult
Questo articolo è una prestampa e non è stato sottoposto a revisione paritaria [cosa significa?]. Riporta nuove ricerche mediche che devono ancora essere valutate e quindi non dovrebbero essere utilizzate per guidare la pratica clinica.
ASTRATTO
Le varianti di SARS-CoV-2 sono diventate un’importante preoccupazione virologica, epidemiologica e clinica, in particolare per quanto riguarda il rischio di fuga dall’immunità indotta dal vaccino. Qui descriviamo l’emergere di una nuova variante. Per dodici pazienti SARS-CoV-positivi che vivono nella stessa area geografica della Francia sudorientale, il test qPCR che seleziona le mutazioni associate alle varianti ha mostrato una combinazione atipica. Il caso indice restituito da un viaggio in Camerun. I genomi sono stati ottenuti mediante sequenziamento di nuova generazione con Oxford Nanopore Technologies su strumenti GridION entro ≈8 h. La loro analisi ha rivelato 46 mutazioni e 37 delezioni risultanti in 30 sostituzioni di amminoacidi e 12 delezioni. Quattordici sostituzioni di amminoacidi, inclusi N501Y ed E484K, e 9 delezioni si trovano nella proteina spike. Questo modello genotipico ha portato a creare un nuovo lignaggio Pangolin chiamato B.1.640.2, che è un gruppo filogenetico gemello del vecchio lignaggio B.1.640 ribattezzato B.1.640.1. Entrambi i lignaggi differiscono per 25 sostituzioni nucleotidiche e 33 delezioni. L’insieme di mutazioni e la posizione filogenetica dei genomi qui ottenuti indicano in base alla nostra precedente definizione una nuova variante che abbiamo chiamato “IHU”. Questi dati sono un altro esempio dell’imprevedibilità dell’emergere di varianti SARS-CoV-2 e della loro introduzione in una determinata area geografica dall’estero.
SARS-CoV-2 è emerso in Cina nel dicembre 2019 ed è stato dichiarato pandemia 21 mesi fa [ 1 ]. Abbiamo dimostrato dall’estate del 2020 che diverse varianti di SARS-CoV-2 sono emerse nella nostra area geografica e hanno causato epidemie distinte, successive o sovrapposte [ 2 , 3]. Inoltre, abbiamo descritto che l’origine di queste varianti era spesso la loro introduzione dall’estero, ma potevano anche essere visoni. Ciò è stato osservato genotipizzando, a partire dal 09/12/2021, SARS-CoV-2 da quasi 40.000 pazienti utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS) di genomi completi per più di 22.000 pazienti e implementando qPCR multipli specifici di ciascuna variante per un più valutazione esauriente della loro diffusione. Da allora e con l’emergere della variante Alpha alla fine del 2020, le varianti SARS-CoV-2 sono diventate un importante problema virologico, epidemiologico e clinico, in particolare per quanto riguarda il rischio di fuga dall’immunità indotta dal vaccino [ 4 – 7 ]. Descriviamo qui l’emergere nel sud-est della Francia di una nuova variante di probabile origine camerunese.
Il caso indice era un adulto diagnosticato per la prima volta come infetto da SARS-CoV-2 mediante PCR a trascrizione inversa in tempo reale (qPCR) eseguita in un laboratorio privato di biologia medica su un campione nasofaringeo raccolto a metà novembre 2021 ( Tabella 1). È stato vaccinato contro il SARS-CoV-2 ed è tornato da un viaggio in Camerun tre giorni prima. Ha sviluppato lievi sintomi respiratori il giorno prima della diagnosi. Vive in una piccola città del sud-est della Francia. Il successivo rilevamento mediante qPCR di tre mutazioni nel gene spike per lo screening delle varianti, come eseguito sistematicamente in Francia in caso di positività SARS-CoV-2, ha rivelato una combinazione atipica con negatività L452R, positività E484K e negatività E484Q (Pentaplex test, ID Solution, Francia) che non corrispondevano al pattern della variante Delta coinvolta in quasi tutte le infezioni da SARS-CoV-2 in quel momento ( Tabella 1). I campioni respiratori raccolti da altri sette pazienti positivi a SARS-CoV-2 che vivono nella stessa area geografica hanno mostrato la stessa combinazione di mutazioni schermate da qPCR. Erano due adulti e cinque bambini (<15 anni di età) ( Tabella 1). I campioni respiratori di questi otto pazienti sono stati inviati all'istituto ospedaliero universitario Méditerranée Infection per il sequenziamento del genoma SARS-CoV-2 come raccomandato dalle autorità sanitarie pubbliche francesi. Durante la notte è stata avviata una procedura NGS rapida. Ha permesso di ottenere l'identificazione del genotipo SARS-CoV-2 in ≈8 ore. In breve, l'RNA virale è stato estratto da 200 µl di tampone rinofaringeo utilizzando il sistema KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA estratto è stato trascritto in senso inverso utilizzando SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific) e il secondo filamento di cDNA è stato sintetizzato con il kit LunaScript RT SuperMix (New England Biolabs) quindi amplificato utilizzando un protocollo PCR multiplex secondo la procedura ARTIC ( https://artic.network /) con pannello di primer ARTIC nCoV-2019 V3 (IDT, Coralville, IA, USA). Infine, NGS è stato eseguito con il kit di sequenziamento della legatura e uno strumento GridION di Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Regno Unito) seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, i file fastq sono stati elaborati utilizzando la pipeline di bioinformatica sul campo ARTIC ( https://github.com/artic-network/fieldbioinformatics ). Le letture NGS sono state richiamate in base utilizzando Guppy (4.0.14) e allineate al genoma di riferimento Wuhan-Hu-1, accesso GenBank n. MN908947.3 utilizzando minimappa2 (v2.17-r941) ( https://github.com/lh3/minimap2 ) [ 8]. Lo strumento ARTIC align_trim è stato utilizzato per mascherare i primer dall'allineamento di lettura e per limitare la profondità di sequenziamento a un massimo di 400. L'identificazione delle varianti candidate a livello di consenso è stata eseguita utilizzando il flusso di lavoro Medaka (0.11.5) sviluppato da ARTIC ( https:// github.com/artic-network/artic-ncov2019 ). Questa strategia ha consentito l'assemblaggio del genoma completo dalle letture NGS ottenute entro 30 minuti dalla corsa per i valori di soglia del ciclo (Ct) di qPCR compresi tra 15 e 27. I genomi SARS-CoV-2 sono stati classificati in lignaggi Nextclade e Pangolin utilizzando applicazioni web ( https: //clades.nextstrain.org/ ; https://cov-lineages.org/pangolin.html ) [ 10 , 11 , 13]. Sono stati depositati nel database delle sequenze GISAID ( https://www.gisaid.org/ ) [ 14 ] ( Tabella 1 ). Le filogenesi sono state ricostruite con lo strumento nextstrain/ncov ( https://github.com/nextstrain/ncov ) quindi visualizzate con Auspice ( https://docs.nextstrain.org/projects/auspice/en/stable/ ). Visualizza in linea Tabella 1.Principali caratteristiche epidemiologiche e virologiche dei casi identificati con infezione con la variante SARS-CoV-2 IHU L'analisi dei genomi virali ha rivelato la presenza di 46 sostituzioni nucleotidiche e 37 delezioni, risultando in 30 sostituzioni di amminoacidi e 12 delezioni ( Figura 1a ; Tabelle supplementari S1 e S2). Quattordici sostituzioni di amminoacidi e 9 delezioni di amminoacidi si trovano nella proteina spike. Le sostituzioni N501Y e E484K sono combinate come nelle varianti Beta, Gamma, Theta e Omicron [ 5 , 15]. La sostituzione F490S è presente come nella variante Lambda e la sostituzione P681H è presente come nelle varianti Lambda e Omicron. In altre proteine strutturali oltre al picco, i cambiamenti degli amminoacidi includono due sostituzioni nella proteina nucleocapside e una nella proteina di membrana. Nelle proteine non strutturali, i cambiamenti degli amminoacidi includono una sostituzione nelle proteine Nsp2, Nsp3, Nsp4, Nsp6, Nsp12 (RNA polimerasi RNA-dipendente) e Nsp13 (elicasi); due sostituzioni in Nsp14 (3'-5'esonucleasi); quattro sostituzioni in Nsp8 (che fa parte del complesso di replica con Nsp7 e Nsp12); e tre eliminazioni in Nsp6. Infine, nelle proteine regolatrici, i cambiamenti degli aminoacidi includono quattro sostituzioni in ORF3a, una in ORF9b e una in ORF8. Inoltre, il codone 27 del gene ORF8 viene trasformato in un codone di stop, come nella variante Alpha [ 16]; alcuni membri della variante Marseille-4 (B.1.160) che ha predominato nella nostra area geografica tra agosto 2020 e febbraio 2021 mostrano anche un codone di stop nel gene ORF8 ma in un'altra posizione [ 3 ]. Virological features and scanning electron microscopy image of the SARS-CoV-2 IHU variant a: Map of the IHU variant genome showing amino acid substitutions and deletions. b: Phylogeny reconstruction performed using the nextstrain/ncov tool (https://github.com/nextstrain/ncov) then visualized with Auspice (https://docs.nextstrain.org/projects/auspice/en/stable/). The genome of the original Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 isolate (GenBank accession no. NC_045512.2) was added as outgroup, in addition to SARS-CoV-2 genomes of Pangolin lineages B.1.640.1 and B.1.640.2. X-axis shows time. c: Representations of the spike of the IHU variant showing the location of all its amino acid substitutions. N-terminal domain (NTD) mutations are in blue; receptor binding domain (RBD) mutations are in red; mutations involved in ACE-2 unmasking are in yellow; mutations at S1-S2 cleavage site are in green; mutations at fusion region are in cyan. d: Scanning electron microscopy image obtained using a SUV 5000 microscope from a respiratory sample positive for the SARS-CoV-2 IHU variant (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan). " data-icon-position="" data-hide-link-title="0" style="-webkit-font-smoothing: antialiased; margin: 0px; padding: 8px; border: 1px solid rgb(255, 255, 255); outline: 0px; vertical-align: baseline; font-style: inherit; font-variant: inherit; font-weight: 400; font-stretch: inherit; font-size: 0.857rem; line-height: inherit; font-family: inherit; text-decoration: none; color: gray; display: block; box-shadow: none; background: rgb(255, 255, 255);">
Figura 1.Caratteristiche virologiche e immagine al microscopio elettronico a scansione della variante SARS-CoV-2 IHU
a: Mappa del genoma della variante IHU che mostra sostituzioni e delezioni di amminoacidi.
b: Ricostruzione filogenesi eseguita utilizzando lo strumento nextstrain/ncov (
